Western Blotting 内参抗体的选择

2022-06-12

       在 Western Blotting 中使用内参,就是在试验中用内参对应的抗体检测内参蛋白。内参 就是内部参照,一般是指管家基因编码表达的蛋白,它们在各个组织和细胞中的表达相对恒 定,常用在检测蛋白的表达水平变化时做参照。

       利用 Western Blotting 可比较在组织细胞蛋白上样等量时,不同条件或不同组织细胞中 目的蛋白的表达量,特别是当目的蛋白表达量不高时,上样量的的差别就极可能影响结果的 分析。因此,在 Western Blotting 试验中,进行内参的检测,可以校正蛋白质定量、上样过 程中存在的误差,保证实验结果的准确性;此外,内参可作为空白对照,检测蛋白转膜是否 完全、整个 Western Blotting 显色发光体系是否正常。目前,在国内外发表的文章中,Western Blotting 作内参校正已成为一种惯例。

       内参抗体种类很多,比如 β-Actin、β-Tubulin、GAPDH、Lamin B、PCNA、Na+/K+ ATPase 等,下面简单介绍下选择内参抗体应遵循的原则:

一. 样本种属来源

       首先要考虑的就是实验样本来源于什么物种。

       哺乳动物的组织或者细胞样本,通常选择 β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、PCNA、 Na+/K+-ATPase 等。

       植物来源实验样本,则可以选择 Plant actin、Rubisco 等。

       其他来源样本研究较少,所以就应该参照文献报导,选择合适的蛋白作为内参。

二. 目的蛋白分子量

       选择内参抗体时,应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋 白分子量相差5KD以上。比如检测目的蛋白分子量为45KD,此时不适宜选择β-actin(42KD) 作为内参,可以考虑选择 GAPDH(36KD)作为内参。

三. 目的蛋白表达部位

       胞浆和全细胞蛋白: β-actin、GAPDH、β-Tubulin 等

       胞核蛋白:PCNA 等

       核膜蛋白:Lamin B 等

       胞膜蛋白:Na+/K+-ATPase 等

       线粒体蛋白:COX IV、VDAC1 等

       以上几条原则只是针对通常情况,但是需要注意的问题是——内参的选择需要考虑实 际的试验环境。比如某些细胞中,由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致 GAPDH 的表达增 高,不适合做内参;比如在在凋亡实验时,Lamin 等也不适合作为内参。因此设计实验方案 的时候应该考虑这些因素并查询相应文献,也应该注意内参表达出现异常。

四. 博士德生物提供了多种内参蛋白抗体,帮助客户选择最合适的内参蛋白抗体。

       β-Actin

       Actin 即肌动蛋白,是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin 大致可分为六种,其中四种是不 同肌肉组织特异性的,其余两种广泛分布于各种组织中,包括 β-actin 和 γ-non-muscle actin。 针对大多数组织和细胞来说的,β-actin 作为内参是公认的,它由375个氨基酸组成,分子量 大小为42KD 左右,广泛分布于细胞浆内,表达量非常丰富,其含量占所有细胞总蛋白的50%。 但是在某些特殊的情况下,如脂肪组织或细胞内,β-Actin 的表达量就很少。

       实验图例:

       Tubulin

       Tubulin 即微管蛋白,是细胞的一种骨架蛋白。Tubulin 分为 α、β、γ、δ、ε 等多种 tubulin, 其中 α-Tubulin 和 β-Tubulin 可以形成异源二聚体,也是形成微管的最主要的两种 Tubulin。 α-tubulin 和 β-tubulin 分子量分别为55kDa 和50kDa,其实际检测条带均在55kDa 左右。作 为内参,β-tubulin 的蛋白水平通常不会发生改变,因此被广泛用于 Western Blotting,其作 为上样量是否一致的参照,也常被用于免疫染色,观察细胞的微管结构。

       实验图例:

 

       GAPDH

       GAPDH 即甘油醛-3-磷酸脱氢酶,是参与糖酵解的一种关键酶,催化糖酵解的第六步, 它还参与核转录、DNA 复制和修复以及细胞凋亡等。它由4个30-40kDa 的亚基组成,分子 量146kDa,检测条带大约在36kDa。GAPDH 基因几乎在所有组织中都高水平表达,广泛 用作 Western Blotting 的内参。但请注意,某些生理因素,如缺氧和糖尿病,会增加 GAPDH 在 特定的细胞和组织的表达。

       实验图例:

 

       PCNA

       PCNA 即增殖细胞核抗原,因其只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内而得名,以后的研 究发现 PCNA 与细胞 DNA 合成关系密切,在细胞增殖的启动上起重要作用,是反映细胞增 殖状态的良好指标。它在细胞核内合成,并存在于细胞核内,由261个氨基酸组成,分子量 为29KD。

       实验图例:

       Lamin B

       Lamin B 即核纤层蛋白 B, 是凋亡关键因素 Caspase 家族的作用靶子,受 Caspase 的 剪切而活化,位于核膜。其由 586 个氨基酸组成,分子量为 66KD。

       实验图例:

       Na+/K+-ATPase

       Na+/K+-ATPase 即 Na+/K+-ATP 酶或 Na+/K+-ATP 泵,它会使细胞外的 Na+浓度高于细 胞内,当 Na+顺着浓度差进入细胞时,会经由本体蛋白质的运载体将不易通过细胞膜的物 质以共同运输的方式带入细胞。其由 1023 个氨基酸组成,分子量为 113KD。

       实验图例:

博士德生物内参抗体及对应二抗抗体:

内参一抗抗体 产品编号 克隆性 适用范围
β-Actin BM0627 小鼠抗人、大小鼠、多种动物单克隆抗体 胞浆和全细胞
BA2305 兔抗人、大小鼠、多种动物多克隆抗体
GAPDH BM1623 小鼠抗人、大小鼠、多种动物单克隆抗体 胞浆和全细胞
β-Tubulin BM1453 小鼠抗人、大鼠、小鼠、兔等单克隆抗体 胞浆和全细胞
PCNA BM0104 小鼠抗人、大鼠、小鼠、兔等单克隆抗体 细胞核
Lamin B BA1228 兔抗人、大鼠、小鼠等多克隆抗体 细胞核(不去除核膜的样本)
Na+/K+ ATPase BM1569 小鼠抗人、大小鼠、兔、多种动物单克隆抗体 细胞膜

 

二抗抗体 产品编号 规格 适用范围
羊抗小鼠 BA1050 0.1ml 小鼠单抗
BA1051 1ml
羊抗兔 BA1054 0.1ml 兔多抗
BA1055 1ml