超滤管的使用方法和注意事项

2022-10-10

       超滤管采用垂直结构的膜减少浓差极化,加快了离心速度,大大了离心所需的时间,整个离心操作大概10-30分钟。倒转离心回浓缩后的样品保证极高的回收率(>90%的高回收率),浓缩倍数可达25~30倍。内置低吸附的Ultracel-PL超滤膜,分别有3KD、10KD、30KD、50KD、100KD五种截留规格,是蛋白质溶液、细胞裂解液、组织培养液等生物样品浓缩、脱盐和缓冲液更换的理想选择。广泛应用于蛋白、抗原、抗体、酶、病毒和微生物等稀溶液或纯化后的蛋白质(如层析洗脱液)的浓缩、脱盐与纯化。

       蛋白浓缩和换Buffer通常使用的超滤管,常用Millipore的Amicon-Ultra-15超滤管(MWCO10kD)。也有其它型号的、不同体积大小和MWCO超滤管可选,视目的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩目标体积而定。

 

技术指标:

       ①大起始样品处理量:15ml(吊篮转子)、12ML(35°固定角度转子),典型浓缩后终体积为200ul;

       ②内置超滤膜为Ultracel-PL纤维素超滤膜;

       ③适合50ML离心机转子;

       ④大离心力:吊篮式转子为4000×g;35°固定角度转子5000×g;

       ⑤尺寸:有效膜面积为7.6cm2,直径为35mm,长度为121mm;

       ⑥管壁上标有截留规格。

 

使用方法:

       1、选择合适的超滤管,主要考虑MWCO和浓缩体积,常见的是Ultra-15(10kD)。到底选择多大截留分子量比较合适呢?10kDa、 5kDa、还是30kDa?通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3,比如目的蛋白分子量为35kDa,就可以选择10kDa截留分子量的超滤 管。若目的蛋白分子量为10kD左右,则可以用截留分子量3kD的超滤管。认真阅读使用说明书,注意超滤膜对各种化学物质的耐受程度有所不同,表格中有。

       2、新买来的超滤是干燥的,使用前加入MilliQ水,水量完全过膜,冰浴或冰箱里预冷几分钟。然后将水倒出,即可加入蛋白液,加入的多少,以不超过管顶的白线为准。操作要轻,加入蛋白液前,超滤管需要插在冰上预冷。

       3、平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快,否则直接损坏超滤膜。开始离心超滤(离心机预冷至4度)。不同离心机的转速 rpm换算成g之后,有所不同。具体可参阅附件里的说明书。离心机的加速度调至低档,减小对膜的压力。注意,一定要等离心机达到目的转速之后,方可离开离心机,否则离心机出问题时,无法时间处理,后果不可预测!膜与转轴的方向根据说明书调整(角转离心机的情况是膜与轴垂直)。在实际使用中,一般转速开的比说明书里的要低,这样可以延长离心管的使用寿命。

       4、当浓缩到剩下1ml时,【取50ul国产Bradford溶液,加入10ul流穿,看有没变蓝色,以此判断超滤管是否漏掉蛋白。如果管漏了,将上层和流穿重新倒入新管中开始超滤。要判断是否漏管,用5mg/ml的BSA离心10min,再取流穿,跑蛋白胶或Bradford粗测】,继续加入剩下的蛋白液浓缩(在冰上操作,防止蛋白受热),直到所有浓缩液都加完为止。离心过程中注意是否发生蛋白沉淀,导致堵管。若发生沉淀,要确定沉淀的具体原因,是蛋白浓度过高还是Buffer不合适;前者可用多根超滤管同时超滤,降低浓度的办法解决,后者的方法是换不同的Buffer,直到蛋白不发生沉淀为止。

       5、前面几步用以浓缩蛋白,如果要换Buffer,在总蛋白液浓缩至1ml左右的时候,轻轻加入新的Buffer(经0.22um超滤膜超滤),再 浓缩至1ml左右,连续三次,后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定,一般不多于500ul,也有浓缩至200ul以内的情况。按照每次至少10倍 左右的体积浓缩算,三次达到1000倍以上,基本上可以达到换buffer的目的。

       6、取出终蛋白浓缩液的操作在冰上操作,用黄枪头(200ul)取,轻轻顺着边缘插入枪头,轻轻吹打、混匀蛋白液,注意不要碰到超滤膜,然后吸取浓缩液,每次吸接近200ul,直到吸完。管底剩下的后一点浓缩液不必吸取,否则难度太大,有可能损坏超滤膜。后加入MilliQ水到超滤管中,没过 超滤膜,防止膜失水变干。

 

注意事项:

       若实验需要截留住目标蛋白,Millipore公司建议选择比目标蛋白大小至少小2-3倍纤维素超滤膜材质的超滤管。如果是聚醚砜超滤膜材质超滤管,则所选择超滤管规格大小比目标蛋白至少小4-5倍。