WB 实验步骤合集

WB 实验流程通常包括样本制备、电泳、转膜、封闭、抗体孵育和检测 6 个部分。这 6 个部分是环环相扣，每一步的疏忽都可能导致一无所获。

1、样本选择和处理

蛋白分子参与生命活动的各个过程，其功能复杂多样，有些蛋白可能只在部分组织和细胞表达（图1）。有些蛋白可能需要诱导，才能表达或表达量增加（图2）。有些蛋白可能存在翻译后修饰，导致其蛋白分子量大小可能与预测不符（图2，3）。有些蛋白可能有多个异构体或者容易被降解，导致出现多条条带的现象（图2）。因此，只有足够了解您研究的蛋白特性，您才能在样本的选择和处理上得心应手，美美的开启您的 WB 之旅。

2、样本制备

样本制备是 WB 实验的开端，裂解液的选择、样本的破碎方法、温度和变性等都会影响样本制备是否成功。

以下是一些样本制备过程中需关注的小细节：

• » 添加复合蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。如果涉及蛋白修饰的检测，需添加相应的去修饰酶抑制剂，例如对于磷酸化修饰蛋白添加复合磷酸酶抑制剂，以防止蛋白在提取时被去磷酸化。
• » 选择合适的裂解液来富集更多靶标蛋白。
• » 超声破碎处理细胞以富集更多靶标蛋白。​

• » 整个样本制备过程中，保持样本置于冰上。
• » 一般来说，蛋 95℃变性5-10min。对于有些多次跨膜蛋白，37℃或者70℃ 10min可能效果更好。
• » 通过Bradford分析、Lowry分析或BCA分析测定样本蛋白浓度。

3、电泳

电泳可以将靶标蛋白与其它蛋白分开，更易检测。不同浓度的分离胶对不同分子量的的蛋白分离效果是不同的。蛋白的上样量，也会影响是否可以检测到有效信号或者获得漂亮的图片。设置阳性和阴性对照不仅有助于分析蛋白功能，在WB实验失败时也有助于分析失败的原因。

在电泳时需要特别关注以下小细节：

• » 根据蛋白大小选择合适的电泳胶浓度，以确保不同蛋白的迁移速率与分离程度最优。具体可参考表1。
• » 表1 不同浓度的分离胶选择

•  
• » 对于分子量较小的靶标蛋白(如分子量<25 kDa），请使用较高浓度的分离胶进行电泳。
• » 对于分子量较大的靶标蛋白（如分子量>100 kDa），请使用较低浓度的分离胶进行电泳。
• » 至少上样20μg总蛋白进行电泳。
• » 建议使用阳性和阴性对照。

4、转膜

转膜是指将蛋白从电泳胶上转移到膜上，方便目标蛋白的检测。转膜缓冲液中SDS和甲醇含量对不同分子量蛋白的转膜影响是不同的。PVDF膜孔径的选择依赖于蛋白分子量大小。转膜结束后，丽春红染色使蛋白可视化，方便判断转膜是否成功。

在转膜时需要特别关注以下小细节：

• » 对于分子量较大的靶标蛋白，建议在转膜缓冲液中加入SDS至终浓度为0.1%。
• » 对于分子量较大的靶标蛋白，建议使用0.45μm的PVDF膜。
• » 对于分子量较小的靶标蛋白，建议使用0.22μm的PVDF膜。
• » 对于分子量较大的靶标蛋白，建议转膜缓冲液中使用10%甲醇或更低浓度。
• » 对于分子量较小的靶标蛋白，建议转膜缓冲液中使用20%甲醇。
• » PVDF膜激活完成后充分清洗，完全去除膜上残留甲醇。
• » 转膜开始前请确认胶与膜之间没有任何气泡。
• » 建议转膜完成后使用丽春红染色，确定转膜是否成功（如果选择荧光标记检测，请确保丽春红完全清洗干净）。

5、封闭

封闭是使未有蛋白吸附的区域被封闭，以防止抗体的非特异性结合，从而降低背景，提高检测灵敏度。常用的封闭液有5%脱脂奶粉和5% BSA或特定封闭液。

在封闭时需要特别关注以下小细节：

• » 没有适用于所有体系的封闭液，请选择合适的封闭液。

6、抗体孵育

抗体孵育通常包括一抗孵育和二抗孵育，一抗可特异性地和靶蛋白相互结合；二抗能辨认一抗的恒定区（具有物种特异性），具有放大信号的作用。

在抗体孵育时需要特别关注以下小细节：

• » 在WB实验过程中，请避免干膜情况。
• » 请根据产品说明书选择合适的抗体工作浓度。如果不清楚给定的未纯化抗体样品的浓度，请参考表2。
• » 表2 抗体使用浓度参考表

• » 建议使用新鲜抗体，不建议抗体重复利用。
• » 抗体孵育时，膜尽量不要裁剪
• » 抗体孵育后充分洗涤，去除非特异性结合

7、检测

二抗通常带有标签，以用作检测。常见检测手段有化学发光和荧光标记等。

在检测时需要特别关注以下小细节：

化学发光检测

• » 显色底物的选择，现配现用，避光处理
• » 显色底物全覆盖在膜上，避免不均

荧光检测

• » 溴酚蓝也会有产生荧光的倾向，最好让它离目的条带远一些