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Folin -酚试剂的配制
1.Folin-酚 A 试剂(需自备)
将 1g Na2CO3 溶于 50ml 0.2mol/L NaOH 中;再把 0.5g(硫酸铜)CuSO4·5H2O 溶于 100ml 1%的酒石酸钾钠(或酒石酸钠)溶液;然后将前者 50ml 与后者 1ml 混合,此试剂只能用一天,过期失效。
2.Folin-酚 B 试剂(SL9010)本试剂的浓度为 1mol/L,此为应用液。
操作方法
1.标准曲线的制作
取 14 支试管分成两组,分别加入 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml 标准蛋白质溶液(250μg/ml),用水补足到 1ml,加入 5ml 试剂甲,混匀,于 20-25℃放置 10 分钟,再加入 0.5ml 试剂乙,立即摇匀,在 20-25℃保温 30 分钟,于 500nm 处比色。测定光密度值,取两组测定的平均值,以蛋白质浓度为横坐标,光密度值为纵坐标,绘制标准曲线值为定量的依据。
2. 样品测定
取 1ml 样品溶液(约合 20-250μg/多肽或蛋白质)加入 5ml A 试剂混匀,于 20-25℃放置 10 分钟,再加 0.5ml B 试剂(Folin-酚),立即摇匀,在 20-25℃保温 30 分钟,于500nm 比色,以 1ml 水代替样品作空白对照。测定后,可以在标准曲线中查出未知样品的浓度。
若用 0.5cm 光程的比色杯进行比色,可按下面方法进行操作:取 0.2ml 样品溶液(约含 5-100μg 多肽或蛋白质)加入 1ml A 试剂(可选用 0.3-0.5cm 直径的小试管)混匀,10 分钟以后,再加入 0.1ml B 试剂,立即混匀,30 分钟后比色。多肽或蛋白质的浓度在 2-25μg,测波长 755nm,而 25μg 以上则采用 500nm 比色为宜。
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