自备试剂

乙醇，氯仿。

操作步骤

（一）样品处理：

1. 骨粉的制备：用自备酒精将骨骼表面擦洗干净，以防污染物对后续 PCR的影响，然后用骨钻在处理干净的骨骼区域钻取骨粉。

2. 如果样品是骨粉成品或商品化骨粉，可以不作处理。

（二）样品裂解纯化：

1.称取 0.2 g 骨粉，转移到 2 mL 塑料离心管中。

2. 加入 1 mL 裂解液I ，充分震荡混匀。

注意：裂解液I 在 4℃ 放置后会析出，使用前请 65℃水浴溶解摇匀后再取用。骨粉加裂解液I 后会很黏稠，需充分震荡混匀。

3.  65℃水浴放置 30 min以上。 

4.  加入 0.3 mL 纯化液II 和 0.2 mL 的氯仿（自备），充分震荡混匀。 

5.  12,000 rpm 离心 3 min，小心将上清液转移到一个新的离心管中。 

（三）DNA收集：

1. 在步骤（二）所得的上清中加入 0.5 mL 结合液III，颠倒混匀。分两次转移到吸附柱中，每次上柱后均先室温放置 2 min，然后 12,000 rpm 离心 1 min，弃穿透液。

2. 在吸附柱中加入500 μL洗涤液，12,000 rpm离心1 min，弃穿透液。重复洗涤一次。

3. 再将吸附柱12,000 rpm离心30 s以甩干乙醇。

4. 将吸附柱放入一个干净的1.5 mL离心管中。在吸附柱中央加入50 μL洗脱液（65-70℃预热），室温静置2 min。12,000 rpm离心2 min。将穿透液重新加入吸附柱中央，12,000 rpm离心1 min以洗脱更多DNA。

5. 检测DNA质量。将所得的DNA保存于-20ºC。

（四）实验建议：

1. 骨粉制备是很关键的步骤，需要将骨骼充分研磨成粉状。

2. 所得的DNA分子量不均一，电泳会呈弥散条带，一般在100 bp—20 Kb 之间，跟骨组织新鲜程度，骨粉的加工方法等有关。

3. 所得DNA经充分纯化，可以直接用于PCR 以及qPCR 等实验。

4. 如DNA产量较低，建议增大样品处理量（相应增加试剂用量）。

注意：如提取量扩大2-3倍（0.4-0.6g骨粉），可以将与结合液III混合的上清分4-6次转移到同一个吸附柱中，可以提高DNA的浓度。

如提取量扩大10倍（2g骨粉），超过吸附柱纯化范围。可以在（二）样品裂解纯化 之后取上清，用异丙醇或者乙醇沉淀法沉淀DNA，用75% 乙醇洗涤沉淀，后用TE溶解DNA（DNA产量比较高，纯度和吸附柱纯化方式相比稍差）。