原理说明

正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡细胞中，PS会从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。用荧光素（FITC、Alexa Fluor488等）标记的Annexin-V作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生；碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将Annexin-V与PI结合使用，就可以检测出细胞群体中的早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞。

使用方法

1. 悬浮细胞，2000rpm离心5min收集细胞;对于贴壁细胞，要用不含EDTA的胰酶消化细胞，胰酶消化时间不宜过长或过短(过长细胞膜破碎，造成假阳性，过短，细胞黏连影响检测)最好是在轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶消化液，加入细胞培养液终止消化，2000rpm离心5min收集细胞。

2. 4℃预冷PBS，洗涤细胞2次（2000rpm x 5min）,收集细胞2～5×105 。

3. 离心弃上清，加入500μL结合缓冲液，轻轻吹打重悬细胞。

4. 加入5μL Annexin V-FITC，轻轻吹打混匀，加入5μL PI 轻轻吹打混匀,室温避光孵育5-15min。(PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高,时间允许，可以在检测前5分钟加入PI)

5. 流式细胞仪检测或荧光显微镜观察。最好在1h内检测。

注意事项

1. Annexin V-FITC与PI量微，请在使用前离心集液。

2. Annexin V-FITC与PI需低温避光储存。

3. PI有毒，能透过皮肤进入体内，使用时注意必要防护。

4. 本试剂盒适用于细胞样本，不适用于组织检测。

5. 检测细胞不能固定。

实验参考

凋亡诱导剂处理JK细胞，37℃，5%CO2培养4h,参照说明书操作，经流式细胞仪检测结果如下：

 处理前 ：正常细胞占比较高，早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞较少。

（红色部分为正常细胞，蓝色为早期凋亡细胞，绿色为晚期凋亡细胞，品红色为坏死细胞 ）

处理后：正常细胞明显减少，早期凋亡细胞明显增加 。