产品简介

Coolaber植物RNA快速提取试剂盒适用于绝大多数植物（包含多糖多酚复杂植物样本）RNA提取，可以简单快速地从各种来源的植物组织中纯化高质量的总RNA。纯化好的总RNA可用于mRNA分离，RT-PCR，Northern杂交等下游分子实验。

操作步骤

（样品裂解，样品纯化，RNA收集）

离心条件均优先选择4℃，室温离心也可以。

一、样品裂解

1. 液氮研磨法

    取1mL裂解液加入1.5mL离心管中。将100mg植物组织用液氮研磨成粉末，将其转移到含有裂解液的离心管中，立即剧烈振荡20秒后用枪头吹打混匀或涡旋震荡使样本充分裂解。 

2.匀浆法

    先将植物组织剪切成小块，放入 10-15 mL 塑料离心管中，加入 1 mL 裂解液。然后用匀浆器匀浆 5-20 秒，确定大部分样品破碎后（匀浆会产生大量泡沫，间断匀浆避免温度过高和泡沫溢出，不影响效果）。将裂解液转移至1.5mL离心管中。

    注意：低温可能导致裂解液有白色悬浮物，请置于65℃水浴充分溶解后使用。裂解液含巯基乙醇，请于通风橱内操作。

二、样品纯化

1. 将裂解物 12,000rpm 离心2-3min，吸取上清1mL到1.5mL离心管。

2. 在上清中加入 0.3 mL 的RNA纯化液 和 0.2 mL 自备氯仿，在振荡器上振荡 30 秒，溶液呈均匀的乳浊状。

    注意：如样品简单，此步可省略。具体操作为：吸取上清1mL，继续12,000 rpm离心10min，取上清后接步骤（二，4）加等体积RNA结合液，上纯化柱。

3.  12,000rpm 离心 3-5min，取上清到新的1.5mL离心管中（避免触及分层界面，下层会有大量DNA和蛋白污染，避免污染。）

4. 上清中加入等体积的RNA结合液，颠倒混匀，分两次加入同一个RNA纯化柱中（如有絮状物或沉淀产生，一并加入纯化柱中）。12,000rpm 离心 1min，弃穿透液。

5. 在纯化柱中加入0.5mL RNA洗涤液，室温12,000rpm离心半分钟，弃穿透液。重复洗涤一次。（洗涤液使用后拧紧瓶盖，防止挥发）

6. 如需去除DNA污染，参照步骤（四）可选步骤，用DNase I处理。

三、RNA收集

1. 将结合有RNA的纯化柱12,000rpm 离心 1min，甩干乙醇。（乙醇的残留将会降低洗脱效果和影响下游实验，或者适当延长离心时间，将有助于乙醇的去除）

2. 弃收集管，将柱芯转移到1.5mL的RNase-free离心管中（自备），加入30-50uLRNA溶解液，室温放置 1分钟，12,000 rpm离心1分钟洗脱RNA。得到的RNA可直接用于后续实验或者 -80℃ 存放。

3. 如果要提高 RNA 产量，加入30-50uLRNA溶解液重复洗脱一次，合并两次穿透液；如果要提高 RNA 浓度，使用第一次的洗脱液 加回到吸附柱中重复洗脱。

注意：建议RNA用于下游实验之前，先进行质量检测。经变性琼脂糖凝胶电泳后，会有清晰的28S和18S条带，以及中间弥散的mRNA条带，其中28S条带是18S条带亮度的1.5-2倍。有时还包括跑在最前面的较暗的5S条带。如果条带不清晰或者弥散，可能是提取过程中或者材料保存过程中RNA发生了降解。小于200bp的RNA分子不能有效结合到吸附柱上。A260/A280 比值1.8~2.0对应RNA纯度90-100%之间。

四、DNA清除（可选步骤）

1.接样品纯化步骤（二，5）。

    DNase I 工作液配置：取RNase-free离心管，加入DNase I 反应液48uL， DNase I溶液 2uL。吹打混匀。（DNase I置于-20℃保存）

2.将 DNase 工作液在 37℃预热 1 分钟，然后全部加入到RNA纯化柱中，室温放置 2 分钟。

注意：2 分钟一般足够降解大多数情况下的 DNA 污染。 如果 DNA 没有彻底降解（可能由于样品中残留的杂质抑制了 DNase 的活性），此步骤可以延长到 5 分钟或 10分钟。

3.直接在纯化柱中加入0.7mLRNA洗涤液，室温离心半分钟，弃穿透液。

4.接RNA收集步骤（三）。