预期用途
无需病毒分离培养,从病例标本、环境样本或培养毒株核酸中靶向扩增新型冠状病毒基因组,结合Illumina或Nanopore高通量测序平台完成病毒基因组测序;实验结果仅供基础研究参考。
检测原理
新冠病毒基因组结构
新冠病毒测序流程
(本试剂盒为逆转录和多重PCR过程)
本试剂盒针对新冠病毒基因组序列设计多重PCR扩增引物,首先对病毒RNA进行逆转录,随后利用多重PCR引物对新冠病毒的全基因组进行靶向扩增。仅需少量RNA即可获得新冠病毒全基因序列,可完美对接二代测序和三代测序平台,结合IPH-Nuno测序分析软件轻松获得新冠病毒基因组序列及变异位点信息。
产品组份
组分名称 | 规格 | 数量 | 储存及运输 |
RT Mix | 80 μl | 1管 | 冷冻运输; -20℃保存; 有效期1年。 |
PCR Mix | 1000 μl | 1管 | |
Primer Pool 1 | 160 μl | 1管 | |
Primer Pool 2 | 160 μl | 1管 | |
Primer Pool 3 | 160 μl | 1管 |
适用仪器
本试剂扩增在ABI、伯乐等普通PCR仪器上进行,反应产物可上二代测序仪和三代测序仪进行建库测序。
样本要求
呼吸道标本;鼻咽拭子、深咳痰液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本等,以上标本经核酸提取后用于全基因组捕获。
实验步骤
1. 逆转录
在 0.2ml PCR管配置以下反应体系,按以下条件反应:
试剂名称 | 体积 | 温度 | 时间 |
RT Mix | 4 μl | 25℃ | 10min |
Viral RNA | 16 μl | 50℃ | 10min |
Total | 20 μl | 85℃ | 5min |
4℃ | hold |
2. PCR扩增
在 0.2ml PCR管配置以下反应体系,轻弹试管,混合,瞬时离心,按以下反应条件:
Primer Pool 1体系:
试剂名称 | 体积 | 温度 | 时间 | 循环数 |
PCR Mix | 12.5μl | 98℃ | 30s | 1 |
Primer Pool 1 | 4μl | 98℃ | 15s | 20-35 |
Nuclease-free Water | 6μl | 65℃ | 5min | |
Template cDNA | 2.5μl | 4℃ | ∞ | 1 |
Total | 25μl |
Primer Pool 2体系:
试剂名称 | 体积 | 温度 | 时间 | 循环数 |
PCR Mix | 12.5μl | 98℃ | 30s | 1 |
Primer Pool 2 | 4μl | 98℃ | 15s | 20-35 |
Nuclease-free Water | 6μl | 65℃ | 5min | |
Template cDNA | 2.5μl | 4℃ | ∞ | 1 |
Total | 25μl |
Primer Pool 3体系:
试剂名称 | 体积 | 温度 | 时间 | 循环数 |
PCR Mix | 12.5μl | 98℃ | 30s | 1 |
Primer Pool 3 | 4μl | 98℃ | 15s | 20-35 |
Nuclease-free Water | 6μl | 65℃ | 5min | |
Template cDNA | 2.5μl | 4℃ | ∞ | 1 |
Total | 25μl |
注:PCR循环数。
CT值 | Illumina建库 | Nanopore建库 |
<20 | 20 | 25 |
20-28 | 25 | 30 |
>28 | 28 | 35 |
注意事项
1. 实验结果仅供基础研究参考;
2. 检测结果与样本的收集、保存、处理及RNA提取密切相关,请妥善进行该过程;
3. 请谨慎处理样本,防止感染;
4. 临床实验室应该严格按照《临床基因扩增实验室工作规范》中的要求配备设备及操作人员,应严格按照说明书要求进行操作。
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