产品简介
Coolaber动物基因组DNA快速提取试剂盒不含巯基乙醇等刺激性试剂,安全无毒。主要用于提取新鲜或者冷冻的动物组织中的基因组DNA。提取的DNA OD260/280 一般在 1.8 -1.9之间,纯度高,不含污染和抑制剂,可以直接用于PCR、酶切、杂交等后续实验。
注意事项
1.裂解液I 和纯化液II 容易产生沉淀,纯化液II 比较粘稠,用前均需要放置在 65℃预热使沉淀溶解、粘稠度降低,用前充分摇匀。
2. 自备试剂:氯仿。
操作步骤
(一)样品裂解:
1. 贴壁细胞
吸尽培养液,在每 10 cm2细胞中加入 0.8 mL 预热的裂解液I ,用枪充分吹打以确保细胞全部裂解,然后把裂解液转移到 1.5 mL 离心管中。
2. 悬浮细胞
离心收集细胞,吸尽液体,在每 1-5×106悬浮细胞中加入 0.8 mL预热的裂解液I,用枪充分吹打以确保细胞全部裂解。然后把裂解液转移到 1.5 mL 离心管中。如果是 fibroblasts 或 carcinoma 细胞,细胞使用量不要超过 1×106 个细胞。
3. 新鲜或冷冻的组织
a. 匀浆处理: 将剪切成小块的新鲜或冷冻保存的组织放入 10 mL 或 15 mL 离心管中,每 50-100 mg 组织加 0.8 mL 预热的裂解液I,用剪切式匀浆器匀浆 30 s左右,然后把裂解液转移到 1.5 mL 离心管中。
b. 液氮研磨: 称取动物组织 50-100 mg ,剪成小块,液氮研磨成粉后,加入已加入0.8 mL裂解液I 的1.5 mL的离心管中。
c. 对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织(细胞中含大量正在复制的 DNA),建议组织的使用量不要超过 50 mg。
(二)样品纯化:
1. 在步骤(一)所得的约0.8 mL的裂解产物中加入 0.4 mL预热的纯化液II,颠倒数次混匀。(由于纯化液II 比较粘稠,可以将 1 mL 枪头剪去一截再吸取)。
2. 65℃水浴 5-10 min。如果室温放置,DNA 产量会降低 10-20%。
3. 加入 200 uL 自备氯仿,震荡混匀 10-30 秒。
4. 12,000 rpm 室温离心 2 分钟。此时上清液将变得透明,中间层有白膜。小心转移上清液到一个新的 1.5 mL 离心管中,避免触及中间层的白膜。
(三)基因组DNA收集:
1. 将步骤(二)所得的上清转移到5 mL或者10 mL的离心管中,加入1.5倍体积的结合液III,颠倒数次混匀后,分多次上同一DNA吸附柱,每次上柱后均先室温放置 2 min,然后 12,000 rpm 离心 1 min,弃穿透液。(也可将上清平均转移到两个1.5 mL离心管中,分别加入1.5倍体积的结合液III )
2. 在吸附柱中加入500 μL洗涤液,12,000 rpm离心1 min,弃穿透液;重复洗涤一次。
3. 再将吸附柱12,000 rpm离心30 s以甩干乙醇。
4. 将吸附柱放入一个干净的1.5 mL离心管中。在吸附柱中央加入50 μL洗脱液(65-70℃预热),室温静置2 min。12,000 rpm离心1 min。将穿透液重新加入吸附柱中央,12,000 rpm离心1 min以洗脱更多基因组DNA。
5. 检测DNA质量。将所得的基因组DNA保存于-20ºC冰箱。
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