产品简介

本产品结合了饱和染料 EvaGreen 和抗体酶的优点，是一款适用于高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting，HRM）分析的专业试剂盒。本品是一种 2× PreMix，PCR 反应液配制十分简单方便；具有分辨率高和模板高度适应性等特点。

与 SYBR Green 不同，EvaGreen 在高浓度情况下不会抑制 PCR 反应；可以使双链 PCR 产物的结合量达到饱和状态，所以称为“饱和染料”。不会产生 SYBR Green 的“染料重排”现象，能够很好的区分扩增产物之间单个碱基的差异。本产品可用于已知 SNP 分析，未知 SNP 筛选，以及未知突变基因扫描和甲基化 PCR 分析等研究。

产品特点

■ 高分辨率：采用 EvaGreen 饱和染料，在饱和状态下具很高的熔解曲线分辨率，可以区分单个碱基的变异。

■ 高特异性：采用抗体修饰的热启动 DNA 聚合酶，降低非特异性扩增，提高特异性。

■ 高稳定性：精心优化 Buffer 体系，增加了熔解曲线的稳定性，提高结果可信度。

■ ROX 校正：单独包装的 ROX 染料，使用更灵活，结果更准确。

下游应用

■ 已知 SNP 分型。

■ 未知 SNP 筛选。

■ 未知突变基因扫描。

■ 甲基化 PCR 分析。

实验结果

图1：使用DP348 提取100 μl 人类血液样本，上样量50 ng，根据NCBI SNP 数据库，选取FEN1 基因的已知SNP (rs174538) 使用Roche LightCycle480 检测，结果如下：

实验结果显示，HRM Analysis Kit 的相同基因型熔解曲线重复性高，不同基因型分辨明确，不存在误判，是理想的SNP 位点分析方法。
SNP 信息：......CGGAAGAACACGTCG[A/G]CAGGAGCAGGCGCCT...... （Allele Frequency：A=0.314，G=0.686）
引物：扩增108 bp 的片段（所用引物FEN1_F：CCTCAACGCTCTCACCATTTTG；
FEN1_R：GGCACTTCCTTTTCCGGTTGTG）

根据NCBI SNP 数据库，选取已知的SNP 进行检测，检测的SNP 信息如下：
RefSNP number：rs174538
Gene Name：FEN1 （flap structure-specific endonuclease 1）
序 列：CGCTCCGCCACCGGAAGAACACGTCG[A/G]CAGGAGCAGGCGCCTAGCACAACCG
Allele Frequency：A=0.314，G=0.686
根据该SNP 位点两侧序列信息，设计引物：FEN1_F：CCTCAACGCTCTCACCATTTTG；

FEN1_R：GGCACTTCCTTTTCCGGTTGTG；扩增PCR 产物长度为108 bp。配置反应体系，在Roche LightCycle480 仪器上运行，检测24 个个体，结果如下：

图2. 对已知SNP 进行检测，NCBI Assay ID 为ss869699；PCR 产物长度为108 bp；24 个检测样本。Roche LightCycler 480 仪器运行,收集熔解曲线信号参数：Ramp Rate 0.05；Acquisitions 12； Genescanning 方法分析。结果中可以看出，HRM Analysis Kit 的不同基因型分辨明确，相同基因型熔解曲线重复性高，不存在误判。

仪器要求
HRM 对仪器的要求较高，ABI 7500 Fast ，ABI 7900HT，Roche LightCycler 480，Qiagen Roter-Gene 等配合专用软件可进行HRM 实验。