特点

•     · 灵敏和特异性的检测miRNA
•     · 利用单一cDNA定量检测多种miRNA
•     · 利用同一cDNA定量检测miRNA和mRNA
•     · 利用同一cDNA定量检测成熟miRNA和miRNA前体
•     · 专有技术合成RNA，评估逆转录效率

产品详情

miScript II RT Kit是miScript PCR System的重要组成部分，用于miRNA定量检测。配合miScript SYBR Green PCR Kit和miScript PCRarrays（miRNome或Pathway-Focused miScript miRNA PCR Arrays）或所需的检测（用于miRNA或其他非编码RNA的miScript Primer Assays、用于miRNA前体的miScript Precursor Assays或用于mRNA的QuantiTect Primer Assays），miScript II RT Kit合成的cDNA可作为real-time PCR 的模板。

miScript II RT Kit缓冲液。

miScript II RT Kit还提供了两种缓冲液。使用miScript HiSpec Buffer合成cDNA，可实现成熟miRNA谱分析（使用miScript miRNA PCR Array）或成熟miRNA的定量（使用miScript Primer Assay）。使用miScript HiFlex Buffer合成cDNA，可实现来自同一cDNA的成熟miRNA、前体miRNA、非编码RNA（ncRNA）和/或mRNA的定量。使用miScript HiSpec Buffer或miScript HiFlex Buffer制备的cDNA可与miScript PCR Controls结合使用。

在miScript HiSpec Buffer中将成熟miRNA选择性转化为cDNA。

在使用miScript HiSpec Buffer进行的逆转录反应中，采用poly（A）聚合酶多腺苷酰化成熟miRNA，并利用逆转录酶及oligo-dT引物扩增将其转变为cDNA。cDNA随后被用于成熟miRNA表达的real-time PCR定量。

在miScript HiFlex Buffer中将各种不同RNA同时转化为cDNA。

在使用miScript HiFlex Buffer进行的逆转录反应中，采用poly（A）聚合酶多腺苷酰化miRNA及其他非编码RNA（ncRNA），并利用逆转录酶及oligo-dT引物扩增将其转变为cDNA。利用oligo-dT和随机引物扩增，使用逆转录酶将mRNA转变为cDNA。使用适当的分析进行成熟miRNA、前体miRNA、其他ncRNA和mRNA检测。

结果具有可重复性。

使用miRNeasy Mini Kit从 [A] 2份相同的HeLa S3细胞沉淀（传代次数相同）和 [B] 2份于不同时间取自不同亲本的HeLa S3细胞沉淀中纯化总RNA。使用miScript PCR System制备cDNA，在real-time PCR中用作模板，进行miFinder miScript miRNA PCR Array分析。重复样本的CT值曲线说明其结果的可重复性高。上述实验是由首次使用miScript PCR System的用户完成的。

性能

miScript II RT Kit配合miScript PCR System的其他组分，灵敏和特异性地检测并定量miRNA。由于许多miRNA表达水平低，灵敏度特别重要，以确保数据的可靠。miScript PCR System灵敏度高、动态范围广和持续高扩增率。其卓越的性能使得初次尝试时即可获得高度重复性结果。

高特异性

miRNAs存在许多miRNA亚型家族，有些只是单个碱基的不同。这使得miRNA定量面临很大挑战。miScript PCR System可有效识别紧密相关的miRNA亚型，即使是只有单个碱基不同的miRNA也可（见表）。

Let-7亚型的RNA序列已列出。粗体有下划线部分为碱基变化。使用miScript II RT Kit和miScript HiFlex Buffer，每个Let-7亚型（Let-7a-Let-7i和miR-98）的合成miRNAs用于cDNA合成反应。相同的实验也可使用miScript HiSpec Buffer，获得相同的结果（数据未列出）。不同cDNA的等分试样作为real-time PCR反应的模板，配合适合不同亚型miScript Primer Assay和miScript SYBR^® Green PCR Kit使用。%相对检测值为所有与miScript Primer Assays不匹配和匹配的C_T值的差值（%相对检测值= 2^-ΔCT x 100）。其值表明miScript PCR System有效识别紧密相关的亚型家族的能力。

原理

miScript PCR System应用SYBR Green-based real-time PCR，能够灵敏和特异性地进行miRNA的定量和谱分析。miScript PCR System可以完成从RNA中合成cDNA及后续的real-time PCR检测miRNAs涉及的所有步骤。

miScript PCR System包含以下组分：

miScript II RT Kit，可简单、单步合成cDNA。单个cDNA合成反应可用于检测数以百计的miRNAs。双缓冲体系满足使用real-time PCR进行miRNA定量的独特要求。

miScript SYBR Green PCR Kit，包含QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix和反向引物miScript Universal Primer，配合miScript Primer Assay或miScript miRNA PCR Array进行miRNAs检测。

miScript Primer Assay或miScript Precursor Assay，前者为miRNA特异性正向引物，用于检测成熟miRNAs。后者包含正向和反向引物，靶向作用于miRNA前体的颈环序列。该产品使用miRBase中的最新序列信息设计。

miScript miRNA PCR Array，miRNome或Pathway-Focused miScript miRNA PCR Arrays被预先设定，单次使用的PCR孔板/孔盘可快速分析成熟miRNAs。

miScript miRNA PCR Array data analysis tool，免费的基于网络的工具，简化了用于miScript miRNA PCR Arrays相对定量的ΔΔC_T方法。

miScript II RT Kit双缓冲体系

miScript II RT Kit包含miScript Reverse Transcriptase Mix、10x miScript Nucleics Mix、5x miScript HiSpec Buffer和5x miScript HiFlex Buffer。miScript Reverse Transcriptase Mix是一种经优化的poly(A)聚合酶和逆转录酶混合物。miScript Nucleics Mix包含dNTPs、rATP、oligo-dT引物和内部合成RNA对照（miRNA逆转录对照[miRTC]），可评估使用miScript miRNA PCR Arrays进行谱分析实验的逆转录性能（获取更多信息，请参考miScript miRNA PCR Array Handbook）。

miScript II RT Kit提供两种缓冲液：miScript HiSpec Buffer和miScript HiFlex Buffer，满足使用real-time PCR进行miRNA定量研究的特别要求。miScript HiSpec Buffer配合miScript miRNA PCR Arrays和miScript Primer Assays进行成熟miRNA谱分析和定量实验时，提供理想的结果。miScript HiFlex Buffer适合于低通量miRNA定量实验，从同一样本进行如miRNA、mRNA和前体miRNA等不同种类的RNA的定量实验除外。

miScript HiSpec Buffer进行逆转录实验

使用miScript HiSpec Buffer进行逆转录反应，确保成熟miRNAs的选择性转化，miScript PCR Controls靶向转至cDNA。使用oligo-dT引物，成熟miRNAs通过poly(A)聚合酶加尾后，被逆转录至cDNA。加尾和逆转录在同一试管内同时进行。oligo-dT引物有一个3'退化锚点和一个在5'端的通用标签序列，可在real-time PCR步骤扩增成熟miRNA。miScript Primer Assays配合miScript SYBR Green PCR Kit，确保通过real-time PCR灵敏、特异性的定量miRNA。加尾和通用标签保证miScript Primer Assays不会检测到基因组DNA。

miScript HiFlex Buffer进行逆转录实验

使用miScript HiFlex Buffer进行逆转录反应，可使所有种类的RNA转化至cDNA。使用oligo-dT引物，成熟miRNAs通过poly(A) 聚合酶加尾后，被逆转录至cDNA。加尾和逆转录在同一试管内同时进行。oligo-dT引物有一个3'退化锚点和一个在5'端的通用标签序列，可在real-time PCR步骤扩增成熟miRNA。miScript Primer Assays配合miScript SYBR Green PCR Kit，确保通过real-time PCR定量miRNA。加尾和通用标签确保miScript Primer Assays不会检测到基因组DNA。其它种类RNA（包括miRNA前体、其它非编码RNA和mRNA）使用oligo-dT和随机引物转化至cDNA。配合miScript SYBR Green PCR Kit，使用合适的检测进行real-time PCR的RNAs检测（如用于非编码RNA检测的miScript Primer Assays 、用于miRNA前体检测的miScript Precursor Assays和用于mRNA检测的QuantiTect Primer Assays）。

操作流程

逆转录反应操作简单。包含miRNA的总RNA作为逆转录反应的起始材料。逆转录是一个简单的流程，包括在37^oC条件下进行1个小时的孵育反应及在95^oC条件下的简单孵育后进行的灭活反应。

应用

miScript II RT Kit作为miScript PCR System的一部分，用于：

    · 成熟miRNA定量检测和谱分析

    · 同时检测miRNA和mRNA

    · 同时检测miRNA和miRNA前体

    · 检测snoRNA和其它非编码RNA